MỤC LỤC

Trang

LỜI NÓI ĐẦU

5

Chương 1.CÁC ENZYME DÙNG TRONG TẠO DÒNG PHÂN TỬ

15

I. Các enzyme hạn chế

15

1.Các endonuclease hạn chế type II

15

2. Gắn các đầu tận cùng được cắt bởi enzyme hạn chế

16

3. Isochizomer

18

4. Methyl hóa

19

5. Cắt DNA bằng enzyme hạn chế

20

II. Các enzyme trùng hợp

22

1. DNA polymerase

22

2. RNA polymerase

26

3. Enzyme phiên mã ngược

27

4. Terminal transferase

28

III. Các enzyme gắn

29

1. Bacteriophage T4 DNA ligase

29

2. Bacteriophage T4 RNA ligase

30

3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase

31

4. Alkaline phosphatase

32

IV. Các enzyme phân cắt

32

1. Deoxyribonuclease I

33

2. Nuclease S1

33

3. Exonuclease III

35

4. Ribonuclease

36

5. RNase H

36

V. Các protein liên kết DNA sợi đơn

37

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

37

Chương 2. ĐIỆN DI GEL

39

I. Nguyên lý chung

39

II. Điện di agarose gel

39

1. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel

41

2. Phương pháp điện di agarose gel

44

3. Quy trình điện di

48

II. Điện di polyacrylamide gel

50

1. Điện di nucleic acid

52

2. Điện di protein

60

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

66

Chương 3. KHUẾCH ĐẠI IN VITRO DNA BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)

67

I. Nguyên tắc của PCR

68

II. Quy trình PCR

72

1. Thành phần phản ứng

72

2. Thực hiện phản ứng

72

III. Tối ưu hóa các điều kiện cho PCR

74

1. Trình tự của primer

74

2. Nhiệt độ của quá trình ủ

75

3. Magnesium

76

4. Các deoxyribonucleotide triphosphate

76

5. Enzyme Taq pol

76

6. Đệm ổn định hoạt động của Taq pol

77

7. Nồng độ các primer

77

8. Nồng độ DNA khuôn mẫu

77

9. Tỷ lệ giữa primer và DNA khuôn mẫu

77

10. Khởi động nóng PCR

78

IV. Thiết kế primer

79

1. Chiều dài primer

80

2. Nucleotide cuối cùng của primer

80

3. Hàm lượng GC và nhiệt độ nóng chảy T_m

81

V. Kỹ thuật RT-PCR

81

VI. Real-time PCR

82

1. Giới thiệu chung

82

2. Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR

83

3. Một số ứng dụng chính của real-time PCR

85

VII. Một số ứng dụng của PCR

85

1. Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp

86

2. Tạo dòng gen bằng PCR

86

3. Ứng dụng trong di truyền

89

4. Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

91

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

92

Chương 4. CÁC HỆ THỐNG VECTOR

93

I. Plasmid vector

94

1. Đặc điểm của plasmid

94

2. Tạo dòng trong plasmid

101

II. Bacteriophage l vector

108

1. Đặc điểm của bacteriophage l

108

2. Tạo dòng trong bacteriophage l

109

III. Cosmid vector

114

1. Đặc điểm của cosmid

114

2. Tạo dòng trong cosmid

114

IV. Bacteriophage M13 vector

117

1. Đặc điểm của bacteriophage M13

117

2. Tạo dòng trong bacteriophage M13

118

V. BAC vector

121

1. Đặc điểm của BAC

121

2. Tạo dòng trong BAC

124

VI. YAC vector

124

1. Đặc điểm của YAC

124

2. Tạo dòng trong YAC

125

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

127

Chương 5. TẠO DÒNG GENOMIC DNA CỦA EUKARYOTE VÀ XÂY DỰNG THƯ VIỆN GENOMIC DNA

129

I. Cắt genomic DNA bằng các enzyme hạn chế

129

II. Tạo dòng các đoạn DNA để xây dựng thư viện genome

131

1. Các plasmid vector

132

2. Các bacteriophage l vector

132

3. Các cosmid vector

133

4. Các BAC vector

133

5. Các YAC vector

134

III. Đóng gói in vitro DNA tái tổ hợp và xâm nhiễm vào tế bào vật chủ

134

IV. Phân tích genomic DNA bằng lai Southern

136

1. Phân tách các đoạn cắt hạn chế của genomic DNA bằng điện di agarose gel

137

2. Chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai

139

3. Lai các mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ với các nucleic acid được cố định trên màng lai

141

V. Sàng lọc thư viện genomic DNA

144

VI. Các phương pháp đánh dấu đoạn DNA bằng phóng xạ

147

1. Đánh dấu ở đuôi

147

2. Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt

148

3. Đánh dấu bằng kéo dài primer

148

VII. Ứng dụng của thư viện genomic DNA

150

VIII. Phân tích trình tự của đoạn DNA được tạo dòng

151

1. Phương pháp hóa học Maxam-Gilbert

152

2. Phương pháp enzyme Sanger

153

3. Xác định trình tự nucleotide trên máy tự động

154

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

157

Chương 6. TẠO DÒNG VÀ XÂY DỰNG THƯ VIỆN cDNA

159

I. Tách chiết, tinh sạch và phân tích RNA

159

1. Tách chiết và tinh sạch RNA

159

2. Phân tích RNA

161

II. Tổng hợp cDNA

163

1. Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất

163

2. Tổng hợp sợi cDNA thứ hai

165

3. Cắt vòng cặp tóc nhờ nuclease S1

166

III. Tạo dòng phân tử của cDNA sợi đôi

167

1. Đuôi đồng trùng hợp

167

2. Các linker và adapter nhân tạo

168

IV. Các phương pháp tạo dòng cDNA khác

171

1. Tạo dòng mRNA-cDNA

171

2. Bổ sung tuần tự các linker khác nhau

172

3. Tạo dòng cDNA bằng các primer-adapter

172

V. Các bacteriophage l vector dùng trong tạo dòng cDNA

175

1. Các bacteriophage l vector được dùng phổ biến

175

2. Một số bacteriophage l vector khác

176

VI. Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm

178

1. Các phương pháp sàng lọc

178

2. Các phương pháp xác nhận các dòng cDNA

183

VII. Xây dựng thư viện cDNA trong bacteriophage l vector

183

1. Chọn lọc kích thước của cDNA

184

2. Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage l

184

3. Phân tích các đoạn chèn cDNA

186

4. Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh

186

5. Khuếch đại thư viện cDNA

187

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

188

Chương 7. BIỂU HIỆN GEN TÁI TỔ HỢPTRONG Escherichia coli

189

I. Sản xuất các protein dung hợp

190

1. Protein dung hợp

190

2. Các hệ thống vector biểu hiện các gen dung hợp với gen lacZ

191

3. Xây dựng plasmid biểu hiện và phát hiện các protein dung hợp

193

4. Tách chiết các protein dung hợp để sản xuất kháng thể

194

II. Sản xuất các protein nguyên thể

194

1. Promoter P_L của bacteriophage λ

196

2. Promoter trp-lac

196

3. Promoter bacteriophage T7

198

III. Xác định mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng